ET A L'ECHELLE MOLÉCULAIRE, COMMENT CELA SE PASSE ?

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1. Création de l’ADN recombinant

 

   In vitro, on va réaliser la découpe du gène d’intérêt à partir d’un ADN bactérien, animal ou végétal mais aussi la suppression de tous les gènes non essentiels à la réplication d’un plasmide bactérien. La découpe des gènes est réalisée par des enzymes de restrictions. Ce sont des protéines qui vont couper les liaisons sucre-phosphate du brin d’ADN dans des sites bien définis. Les enzymes ADN ligases vont ensuite recoller les fragments d’ADN pour créer un plasmide recombiné portant le gène d’intérêt. Ces enzymes sont constituées d’un site de reconnaissance de molécules donneuses (groupement OH d’un nucléotide) et acceptrices (groupement phosphate d’un autre nucléotide). Elles utilisent l’énergie d’une molécule d’ATP pour créer des liaisons phosphodiester entre deux nucléotides.

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2. Réinsertion du plasmide par transfection :

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   La paroi végétale : un obstacle de taille ! En effet, la paroi végétale est une paroi pectocellulosique qui fait office de barrière naturelle imperméable et préformée contre les agents pathogène. On doit donc trouver un moyen de forcer l’entrée du plasmide recombiné.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

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A) Par transformation artificielle chez Agrobactérium ou E.Coli

     La transformation est l’intégration d’un fragment d’ADN étranger dans une cellule. Chez les bactéries elle se fait de manière naturelle lorsque la bactérie se trouve sous un “état de compétence” qui n’apparaît qu’à certains stades de la division cellulaire. Cet état va permettre la synthèse d’un activateur de la paroi excrété par la bactérie. L’ADN à intégrer va alors se fixer sur la paroi bactérienne au niveau de récepteurs, dans les conditions strictes de "l’état de compétence”.
       Il est alors possible de réaliser une transformation artificielle. Pour cela, on va rendre une bactérie compétente, issue de la division de cellules au cours de la phase exponentielle. A ce moment là, on va étirer la membrane bactérienne afin de rendre la paroi cellulaire plus perméable.
      A cela sont couplés  le refroidissement de la bactérie et sa mise en contact avec une solution de chlorure de calcium. La solution permet de neutraliser les charges de l’ADN et le refroidissement crée un choc thermique qui forme des pores dans la membrane permettant le passage de l’ADN. Celui-ci va ensuite venir s’intégrer dans le génome de la bactérie. Elle va à présent pouvoir transmettre l’ADN recombiné directement à la cellule végétale.
      La bactérie va pouvoir entrer dans le cytoplasme par l’intermédiaire d’une “blessure” déjà présente sur la plante. Sinon, celle-ci va sécréter des effecteurs apoplastiques de type Cell Wall Degrading Enzymes (CWDE) qui vont participer à la dégradation de la paroi végétale. Une fois entrée dans le cytoplasme, la bactérie libère des effecteurs apoplastiques de type protéases ayant pour but d’inhiber les molécules et enzymes de défenses de la plante pour se protéger. L’ADN recombiné va finalement pouvoir être intégré dans le génome de la plante par mécanisme de transfert de gène naturel par la bactérie.

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B) Par électroporation :

    In vitro, on dégrade la membrane plasmique des cellules végétales afin d’obtenir un protoplaste en faisant agir du lysosome. A l’aide d’un électroporateur, on crée un champ électrique intense et bref qui entraîne la formation de pores dans la membrane. Pour éviter la formation d’un arc électrique lors du passage de l’ADN chargé négativement, on le met en solution dans de l’eau très pure ou déionisée. Une fois entré dans le cytoplasme l’ADN peut ainsi atteindre le noyau et intégrer le génome de la cellule végétale. 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

C) Par biolistique :

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     La paroi végétale est “trouée” lors de la projection des microbilles d’or ou de tungstène et l’ADN est directement envoyé à proximité du noyau.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

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Remarque : L’intégration du transgène dans le génome de la plante se fait de façon aléatoire

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