PRINCIPES DE LA TRANSGENÈSE

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Etape 1 : Isolement du gène fonctionnel ou des différentes parties devant servir à construire un gène fonctionnel.

        En premier lieu il faut déterminer le caractère que l’on souhaite introduire dans la plante. La protéine responsable de ce caractère est le gène codant la  protéine, appelé gène d’intérêt. Ce gène peut provenir de tout organisme vivant (plante, animal, bactérie) car le code génétique est universel. Ensuite le gène doit être isolé de l’organisme donneur à l’aide d’enzymes de restriction avant d’être intégré dans une séquence d’ADN.

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Etape 2 : Construction d'un gène et association avec un gène de sélection.

 

       Le gène seul ne peut pas s’exprimer dans une cellule végétale, il doit être associé à un promoteur placé avant la séquence d’ADN codante et nécessaire à l’enclenchement de la transcription. De même, un terminateur doit marquer la fin de la séquence d’ADN codante.

On associe aussi souvent au gène d’intérêt, un gène marqueur apportant une résistance à un antibiotique. Celui-ci permet alors la reconnaissance et la sélection des cellules ayant intégré le gène d’intérêt à leur génome. Le gène marqueur principalement utilisé pour la transgénèse est le gène néomycine phosphotransférase type II ou "gène néo" qui apporte une résistance à la Kanamycine. 
       Après avoir assemblé tous ces éléments in vitro, on obtient alors une construction génétique fonctionnelle qui est clonée afin de disposer d’une quantité suffisante d’ADN à introduire. Le clonage est réalisé à l’aide d’une molécule d’ADN circulaire des bactéries appelée "plasmide". Le plasmide “recombiné” va héberger la construction génétique obtenue transférée dans le plasmide à l’aide d’enzymes de restriction et de la ligase. Pour finir le plasmide est réinjecté dans la bactérie hôte  (Escheria coli la plupart du temps), qui va être cultivée et entraîner une multiplication efficace du plasmide.

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Etape 3 : Transfert du gène à la plante.

 

Il existe deux principales catégories de méthodes pour introduire un gène dans une cellule végétale : les méthodes indirectes et directes.

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1. Les méthodes de transfert indirect

 

 

 

A) La transformation biologique

 

       C’est l'une des méthodes les plus utilisées. Cette méthode agit par le biais d’une bactérie, dont le choix est complexe car il faut tenir compte du caractère pathogène et non pathogène de cette dernière mais aussi de la spécificité des cellules cibles.

      On utilise principalement la bactérie Agrobactérium issue du sol et qui réalise naturellement un transfert de gène chez les plantes afin de les parasiter en entraînant la maladie de la Galle du Collet.

       En effet on a découvert qu'Agrobacterium réalisait un transfert d’une partie de son plasmide : l’ADN-T. C'est une partie constante du plasmide Ti (tumor inducing) de la bactérie, il est délimité par des bordures droites et gauche composées de séquences de 25 nucléotides et contient des gènes provoquant la création de tumeurs, ainsi que la sécrétion d’opines favorisant la multiplication des souches pathogènes dans le génome de la plante. 
   Ces constatations ont permis de développer la technique de vecteur binaire qui consiste à détourner l’activité d’Agrobactérium tout en conservant sa capacité de transfert naturel de gène. Pour cela, on va utiliser deux types de vecteurs :

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• Le premier est un vecteur de transfert et de clonage. Il s’agit d’un plasmide Ti portant l’ADN-T recombiné, c’est-à-dire comportant à la place des oncogènes supprimés, la construction génétique à introduire. Le plasmide est capable de transférer son ADN-T recombiné à la plante mais aussi de se répliquer à l’intérieur des bactéries Agrobactérium et E coli.

• Le deuxième plasmide permet de provoquer à distance le transfert de l’ADN-T recombiné à la plante. Il est question d’un plasmide Ti d’Agobactéium sur lequel on a provoqué une délétion de la partie oncogène du plasmide “désarmé” mais conservant ses gènes de virulence indispensables au transfert. Ainsi, cette technique du vecteur binaire permet d’employer une bactérie comme intermédiaire pour réaliser un transfert “naturel” de gène.

 

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B) La lipotransfection

 

    Son principe repose sur l”emprisonnement” du gène d’intérêt dans un liposome qui va ensuite fusionner avec la membrane des protoplastes de la plante. Le liposome va ensuite libérer le gène d’intérêt dans le cytoplasme de la cellule qui va potentiellement parvenir jusqu’au noyau de la cellule et s’y intégrer, mais ces gènes restent une minorité.

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2. Les méthodes de transfert direct

 

 

Ces méthodes ne font pas appel à un intermédiaire sous la forme d’un organisme vivant. Cette catégorie se divise en trois techniques majeures :

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 A) La biolistique ou le canon à particule

 

      C’est la technique de transfert direct la plus utilisée. Elle consiste à “bombarder” les cellules ou le tissu végétal de billes d’un micromètre de diamètre constituées d’or ou de tungstène et enrobées d’ADN collé grâce à une solution de spermidine.

      Les microbilles sont projetées par un “canon” qui est en réalité une bouteille de gaz sous pression contenant de l’hélium liquide par exemple. La pression de ce gaz de l’ordre de 200 atmosphères est ensuite ramenée à une pression de 5 à 8 bar et permet de remplir une petite chambre fermée par une électrovanne. A son ouverture, le gaz est brutalement libéré et projette les microbilles sur la boîte de pétri où l’on a placé le matériel végétal.

     Seules certaines cellules atteintes vont réussir à intégrer l’ADN porteur du transgène. Si celui-ci pénètre dans le noyau d’une cellule et parvient à identifier, dans le génome de la cellule, une région complémentaire avec la séquence du transgène, alors il est intégré par un échange de type crossing-over et la cellule pourra transmettre son nouveau caractère à ses descendants. Cependant, cette technique n’est utilisée que pour les plantes difficilement transformables par transfection biologique.

 

B) La microinjection

 

      C’est une technique déjà utilisée dans les recherches en physiologie et qui consiste à introduire directement le gène d’intérêt dans le protoplaste à l’aide d’un micromanipulateur associé à un microscope photonique inversé. Pour cela, on maintient un protoplaste à transformer sur lequel on va amener au contact l’extrémité d’une micro-aiguille de verre contenant l’ADN à injecter. L’aiguille est reliée par un cathéter à une seconde seringue qui va libérer le contenu de la micro aiguille dans le protoplaste. Le protoplaste transformé est alors libéré, remis en culture et suivi jusqu’à la régénération de la plante. Cependant, il est nécessaire d’injecter un millier de copies du gène pour parvenir à intégrer le gène dans une cellule.

 

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 C) L’électroporation

 

      C’est une technique déjà largement utilisée dans les laboratoires travaillant sur les microorganismes. Cette technique associe une culture de protoplastes et une solution concentrée d’ADN plasmidique contenant le gène d’intérêt que l’on veut transférer. Ces derniers sont placés dans une chambre munie d’électrodes entre lesquelles ont fait passer un champ électrique de 200 à environ 1000 volts pendant une durée de quelques micro à millisecondes. Les chocs électriques provoquent la déstabilisation de la membrane plasmique des protoplastes et entraînent l’ouverture des pores membranaires. L’ADN recombiné peut ainsi entrer et accéder au noyau.

 

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Etape 4 : Contrôle de la présence et du bon fonctionnement du gène transféré chez le receveur.
 

      Pour s’assurer que la plante aie bien intégré la construction génétique, on va vérifier la présence du gène marqueur en mettant la plante en contact avec un agent sélectif. Si la plante est résistante à cet agent, alors elle a bien intégré la construction génétique dans son génome.

     Ensuite, des analyses plus poussées sont réalisées pour vérifier si le gène d’intérêt à bien été intégré. Le processus se divise en 4 étapes :

 

Phase 1 : On réalise une PCR qui a pour but d’amplifier la séquence d’ADN de façon à en  obtenir suffisamment pour réaliser une électrophorèse et procéder à un tri rapide des OGM.​

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Phase 2 : On réalise la technique de Southern blot. L’ADN de la plante est digéré séparément par des enzymes différentes, les fragments d’ADN sont séparés par électrophorèse et hybridés pour déterminer le nombre de copies du transgène et les sites d’intégration.

 

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Phase 3 :  On va vérifier que le gène d’intérêt transmis produit bien la protéine désirée et dans une quantité suffisante. Pour cela on réalise un test ELISA (Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay) :

• Après avoir extrait les protéines de la plante, on les mets en présence d’un antigène capable de reconnaître la protéine produite par le transgène.

• On réalise ensuite un lavage qui permet d’enlever les protéines non fixées à l’anticorps.

• A cela on ajoute un nouvel anticorps spécifique de la protéine recherchée mais cette fois-ci fluorescent.

• Si l’on observe une fluorescence de la solution, le gène à bien été introduit dans la plante et à codé la protéine recherchée.

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